Es gab aber schon lange zuvor im umliegenden Raum verschiedene Siedlungen, deren Ursprung durch archäologische Funde nachgewiesen ist. So war an der Stelle des Hambacher Schlosses einst eine Fliehburg der Kelten. Auch die Römer haben, wenn auch nur spärlich, ihre Spuren hinterlassen. Und das 1892 nach Neustadt eingemeindete frühere Dorf Winzingen erscheint bereits 774 in einer Urkunde des Klosters Wissembourg.
Auf Pfalzgraf Ruprecht I. aus dem Hause Wittelsbach, von Kaiser Karl IV. 1356 mit der Kurwürde versehen, die von nun an fest mit der Person des jeweiligen Pfalzgrafen verbunden war, geht die Gründung eines Kollegiatstifts (1356) und der 1368 begonnene Bau der Stiftskirche zurück. Das jahrhundertealte Wahrzeichen der Stadt sollte, so der Wille seines Erbauers, als Begräbnisstätte der kurfürstlichen Familie dienen. Als Sitz eines Oberamtes war Neustadt, das 1275 von König Rudolf I. von Habsburg das Stadtrechtsprivileg verliehen bekam, bis zum Ende der Kurpfalz ein Verwaltungsmittelpunkt des kurfürstlichen Herrschaftsgebietes und zeitweilig auch Nebenresidenz zu Heidelberg. Auf Kurfürst Ruprecht I. ist im übrigen auch die Gründung der Heidelberger Universität (1386) zurückzuführen, die u. a. auch durch Pfründe des Neustadter Stifts finanziert wurde. Geistigen und auch wirtschaftlichen Aufschwung, wenn auch nur für wenige Jahre, erbrachten die konfessionellen Auseinandersetzungen während der Reformationszeit zwischen dem lutherischen Kurfürsten Ludwig VI., der in Heidelberg residierte, und dessen jüngerem Bruder, Pfalzgraf Johann Casimir. Letzterer hatte das Erbe für weite Teile westlich des Rheins angetreten, wo er den von seinem Vater eingeführten calvinistischen Glauben beibehielt.
Ludwig VI. dagegen führte in seinem kurpfälzischen Erbteil alsbald nach dem Tode seines Vaters wieder den lutherischen Glauben ein und vertrieb damit einhergehend die calvinistischen Professoren und Studenten der Heidelberger Universität. Sein Bruder, Johann Casimir, bot ihnen in Neustadt Asyl und gründete 1578 in dem nach ihm benannten „Casimirianum“ eine Gegenuniversität. Der frühe Tod Ludwigs VI. beendte allerdings schon 6 Jahre später die kurze Blütezeit Neustadts. Johann Casimir siedelte 1583 nach Heidelberg über, um dort die Regentschaft für den noch unmündigen Sohn Ludwigs zu übernehmen.
Nachdem die reformierte Neustadter Hochschule wieder nach Heidelberg zurückverlegt worden war, verliessen 1585 die letzten Professoren und Studenten das Casimirianum. Den 30jährigen Krieg überstand Neustadt trotz wechselnder Eroberungen durch spanische, schwedische, französische und kaiserliche Truppen, verbunden mit Entbehrungen, Hunger, Elend und Tod, weitgehend unbeschadet. Und auch im Pfälzischen Erbfolgekrieg, als die Truppen von Ludwig XIV, nahezu die ganze umliegende Pfalz in Schutt und Asche legten, blieb die Stadt zumindest von Brandschatzungen und schwerwiegenden Zerstörungen verschont. Im Verlauf der Französischen Revolution wurde Neustadt erneut in das Kriegsgeschehen einbezogen und nach wechselnden Eroberungen schließlich 1801 im Frieden von Lunéville dem französischen Staatsgebiet einverleibt. Herrschaftliche Güter und Kirchenbesitz wurden zum Großteil säkularisiert.
Der Wiener Kongreß hatte für die Stadt zur Folge, dass sie 1816 mit der gesamten Pfalz der bayerischen Krone einverleibt wurde. Obwohl nur von kurzer Dauer, hatte die französische Herrschaft nachhaltige Wirkung, indem sie die Pfälzer zu freien und gleichberechtigten Staatsbürgern gemacht hatte. Mit ihren oppositionellen Forderungen nach mehr politischen Freiheiten gerieten sie deshalb alsbald in Mißkredit bei der bayrischen Regierung und beim Königshof. Mit dem Hambacher Fest von 1832 wurde erstmals ein demonstratives Zeichen für die Forderung nach mehr Freiheit in Deutschland und nationaler Einheit gesetzt. Erstmals wurde in Hambach auch die deutsche Nationalflagge mit den Farben Schwarz-Rot-Gold gehißt. Neuen Aufschwung brachte die Eröffnung der Bahnstrecke Ludwigshafen –Neustadt (1847), die zwei Jahre später bis hin zur damaligen preußischen Grenze bei Bexbach (heute Saarland) verlängert wurde. Der 1. Weltkrieg endete mit der Besatzung der linksrheinischen Gebiete und somit auch von Neustadt durch französische Truppen, die bis in die Junitage 1930 andauerte.
Nach dem 2. Weltkrieg, den die Stadt ohne allzu große Zerstörungen überstanden hatte, wurde die Pfalz und damit auch Neustadt Bestandteil des neugegründeten Landes Rheinland-Pfalz und 1952 Sitz der Bezirksregierung. Ihre heutige Größe erlangte die Stadt mit der im Jahre 1969 vollzogenen Verwaltungsreform des Landes Rheinland-Pfalz. Damals wurden die alten Winzerorte Diedesfeld, Geinsheim, Gimmeldingen, Haardt, Hambach, Königsbach, Lachen-Speyerdorf und Mußbach mit der Kernstadt verschmolzen. Fünf Jahre später folgte der heutige Ortsbezirk Duttweiler. Damit vergrößerte sich das Stadtgebiet insgesamt von 1.700 ha auf rd. 11.700 ha; hinzu kamen über 20.000 Neubürger.